第四节 常用高通量筛选技术——芯片技术
芯片技术，又名微阵列技术，通常是由玻璃、硅芯片、尼龙薄膜制作而成的二维阵列，具有快速、微型化、多通道和平行处理的特性，同时可以对大量生物材料进行高通量筛选、检测和分析。1983年，在Tse Wen Chang的抗体微阵列（又称抗体基质）和一系列专利中首次介绍和阐述了微阵列的概念和方法。1995年，斯坦福大学Ron Davis和Pat Brown关于基因芯片的论文在Science发表后，“基因芯片”产业开始显著增长。随着多家公司的成立，DNA微阵列技术应用广泛，而蛋白质、组织、细胞、糖和化合物等微阵列的应用也越来越广泛。作为新型的肿瘤标志物筛选研究应用技术，生物芯片技术的快速发展为自动化、高通量寻找肿瘤相关标志物带来了巨大的技术变革。
一、芯片的分类
生物芯片主要包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片和糖芯片等，可以分别从核酸水平、蛋白水平和组织水平对样本进行检测。
1.基因芯片也被称为DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray）。它既能测量DNA，又能将DNA作为其检测系统的一部分。DNA微阵列可以细分为四类：cDNA微阵列、寡核苷酸DNA微阵列、BAC微阵列和SNP微阵列。
2.蛋白质芯片也被称为蛋白质微阵列。它能够以高度并行的方式表征数十万种蛋白质。若微阵列为抗体，则被称为抗体芯片，主要用于抗原分子的检测。
3.组织芯片是将圆柱状组织在石蜡块中排列组成的微阵列，主要用于病理学研究。
4.糖芯片也被称为多糖微阵列。主要用于筛选及鉴定与碳水化合物结合的蛋白质组。
二、芯片的在肿瘤标志物中的应用
在肿瘤基础研究与临床诊断方面，利用芯片技术比较基因表达谱和蛋白质表达谱在病变组织与非病变组织中的差异，能够筛选肿瘤易感及对肿瘤诊断、分型、靶向治疗等有价值的肿瘤标志物；也可用于多种肿瘤的检测研究，以及肿瘤分期、分级和预后判断、多种肿瘤标志物的联合检测等领域。
（一）基因芯片
基因芯片是20世纪90年代后逐渐发展起来的一种新的DNA定性和定量分析技术。它是由大量的DNA片段或寡核苷酸片段高密度有序排列所形成的探针阵列，其基本原理是通过DNA碱基序列互补配对检测生物信息。即在一个固相载体上固定了已知序列的靶核苷酸的探针，将待检样品中的DNA、RNA或反转录得到的cDNA经过荧光标记后，通过与核酸探针进行点杂交，再经过激光共聚焦荧光显微镜检测荧光信号，并借助计算机系统对荧光信号进行分析处理，得出待测样本中的基因序列和表达水平的信息，从而实现了定性和定量分析。基因芯片能在一个微小的硅片、玻片等基片表面集成大量的分子靶向探针，能够同一时间内对同一个核酸样本中数万种基因的多态性、突变及表达进行高通量、高精确度的检测分析。
基因芯片根据不同的探针类型分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片，根据作用的不同分为检测基因质和量的芯片。检测质的芯片包括检测基因突变、SNP、甲基化及DNA测序的芯片，主要是采用寡核苷酸芯片；检测量的芯片包括检测基因的拷贝数及转录组mRNA表达水平的芯片，主要由cDNA芯片来完成。
基因芯片技术具有高通量、高精度、高敏感性和自动化的优点，它的出现对于生物学、检验医学和肿瘤学等多学科的发展都有着极大的推动作用。基因芯片在肿瘤标志物的筛选和检测中得到了广泛的应用，能够大规模、高效率地检测基因的表达情况。不同肿瘤甚至是同一种肿瘤对药物的敏感性都存在个体的差异，基因芯片的高通量和高效率的检测能力非常适合于分析不同肿瘤患者成百上千个基因表达谱的变化，进而对不同肿瘤患者的个体化诊治和预后提供大量信息。
miRNA芯片是用来检测miRNA表达谱的一种生物芯片，将寡核苷酸先固定在芯片介质上，再通过杂交方式与样品中的miRNA结合，以鉴定miRNA表达与否，及表达高低。由于死亡的癌细胞会释放一部分癌症特异的miRNA进入血液循环系统中，这部分miRNA就能作为生物标志物进行肿瘤的早期诊断。樊嘉教授课题组使用miRNA芯片检测了肝癌患者、肝硬化患者、慢性乙型肝炎患者及正常人群中的血浆miRNA表达谱。建立了一个包含7个miRNA的多指标的logistic回归分析模型，用以肝癌的早期诊断，说明miRNA芯片能够在肿瘤标志物的筛选中发挥重要的作用。
（二）蛋白质芯片
蛋白芯片也称为蛋白质微阵列，是将不同种类的纯化蛋白质固定在固相基质上制成。通常使用机器人直接在玻片上点样，或者采用压电喷墨打印，也可以采用原位合成的办法。蛋白质芯片可以分为两大类：一种是正相芯片（forward phase arrays），该芯片是将捕获蛋白质的物质固相化在玻片的表面，该物质通常为抗体、aptamer（能结合蛋白或其他小分子物质的单链或双链寡核苷酸）或者其他蛋白质，检测样本可以是血液、淋巴液、脑脊液、分泌液、尿液、细胞裂解液等生物学标本，捕获的分析物随后可利用荧光染料直接检测。目前已经有一些商品化的产品，如蛋白抗体芯片Ab Microarray 380和Proto Array人类蛋白芯片。另一种是反相芯片（reverse phase arrays，RPPA），即把样品固定在固体支持物上，将单个可溶的探针如抗体溶液与芯片孵育，用于分析检测在不同样品中的目的蛋白，可用于大量组织样品、细胞样品或细胞样品碎片的不同种类蛋白质的检测。
蛋白芯片根据不同载体的性质还可以分为固相芯片和液相芯片。固相芯片是在固相基质上固定了多种抗体，利用生物芯片技术的并行检测能力，可以捕获待测样本中的靶蛋白，目前在临床上广泛用于多肿瘤标志物的联合检测。液相芯片是新近发展起来的一种以荧光微球为载体的技术，反应体系是在悬浮溶液中。与固相芯片相比较，液相芯片具有操作简便、节省标本及准确度高的优点，是唯一被美国FDA批准应用于临床诊断的生物芯片。
蛋白质是生命活动的执行者和体现者，是细胞功能的最终驱动力，在癌症的发生、发展中发挥重要的功能。在癌症的预警、早期诊断、治疗反应和预后转归判断中具有重要的意义。由于单一肿瘤标志物检测常常缺乏足够的诊断敏感性和特异性，特别是对早期肿瘤的检测率不高，蛋白芯片技术的发展恰好为多肿瘤标志物联合检测提供了理想的工具。
1.蛋白质芯片在肿瘤标志物发现中的作用
（1）蛋白质芯片用于发现癌相关的肿瘤标志物：
蛋白芯片早期的研究由92个抗体组成的抗体阵列来分析从142名胰腺癌、良性胰腺疾病或者健康人血清中的蛋白质含量。结果发现该芯片能够区分癌症患者和正常人，敏感性和特异性大于90%。在另一项研究中，采用单链抗体（scfv）芯片用于检测胰腺癌患者的血清样本。与健康血清对比，发现由21种蛋白质组成的蛋白质特征可能与癌症患者有关。使用由378个单克隆抗体组成的商业化微阵列，鉴定乳腺癌与正常组织的异常表达蛋白，发现了包括酪蛋白激酶1 epsilon（CSNK1e），p53（TP53），细胞分裂周期25c（CDC25c），膜联蛋白A11（ANX11），真核翻译起始因子4e（EIF4e），有丝分裂原激活蛋白激酶7（MAPK7）在内的一些潜在的生物标志物。
使用RPPA作为工具研究发现了一些潜在的生物标志物。研究人员对12个不同组织来源的90个细胞系的裂解液进行磷酸化抗体检测，确定了磷酸肌醇3-激酶（PI3K）信号通路在不同的肿瘤类型中上调，血管内皮生长因子（VEGF）通路下调，而EGFR信号是所有细胞中最异质的通路。利用抗体芯片分析了转移性乳腺癌患者的血清，发现由11种生物标志物的组合能够区分癌症和健康人，敏感性和特异性达到95%。这些研究表明蛋白质芯片在发现癌相关的肿瘤标志物方面具有价值。
（2）蛋白质芯片用于发现癌转移标志物：
在乳腺癌的研究中，使用抗细胞因子抗体阵列检测不同表达水平的乳腺癌中的细胞因子，发现白细胞介素8在乳腺癌发生中起到关键作用。除了细胞因子，血清中的其他蛋白质也可能具有提示癌症转移的作用。应用RPPA技术识别34个软组织肉瘤的（STS）骨转移样本与健康的骨组织不同信号通路之间的交互作用，发现在骨转移中，与细胞基质重塑、细胞黏附和生长/存活比有关的蛋白质均高于正常骨组织。此外，还发现了syndecan-1、PY576/577黏着斑激酶（FAK）、PY317-SH2结构域、转化蛋白（SHC）、EGFR、PY1135/1136胰岛素样生长因子（IGF）和PI3K/AKT是STS骨转移的显著特征。核因子受体激活、RANKL、PT37/46真核翻译起始因子4e结合蛋白1（4EBP1）、EGFR、PY1135/1136-igf-1受体（IGF1R）、PY41-src、PY317-SHC和PI3K p110 gamma（PI3KP110C）上调的患者生存期缩短。这些研究说明蛋白质芯片能够用于肿瘤转移标志物的发现。
（3）蛋白质芯片用于发现癌耐药相关标志物：
有研究采用了可以识别各种信号的224个抗体阵列，确定了与多柔比星抵抗有关的信号分子，说明蛋白质芯片能够用于肿瘤药物耐药性的研究，显示出改进个性化药物的潜力。使用RPPA定量检测携带突变EGFR的非小细胞肺（NSCLC）癌患者样本中的EGFR磷酸化，并与携带野生型EGFR的患者进行比较，发现在tyr-1148和tyr-1068位点的磷酸化同时升高，在EGFR的tyr-1045位点的磷酸化降低。此外，他们还检测到与EGFR相关的信号蛋白磷酸化降低，包括人表皮生长因子受体2（HER2）Tyr-1248、胰岛素受体底物1（IRS-1）Ser-612和Smad的Ser-465/467位点。为了评估哪些磷酸化亚群与配体诱导相关，他们检测了EGF配体刺激NSCLC细胞系后突变型和野生型EGFR的115种信号蛋白的磷酸化时间进程。在EGF配体刺激下，带有L858R的EGFR突变细胞株H1975在EGFR的tyr-1045和HER2的tyr-1248位点表现出与肿瘤组织中相似的磷酸化模式。此外，在EGFR突变细胞株H1975中发现Akt在Ser-473处的磷酸化持续存在。该研究探索了含有EGFR酪氨酸激酶域突变的细胞株体内多个位点特异性磷酸蛋白，提示蛋白质芯片能够用于发现非小细胞肺癌潜在耐药标志物。
2.蛋白质芯片在肿瘤早期筛查及辅助诊断中的作用
蛋白质芯片具备高通量、微型化、高敏感性的特点，仅需小量血样就可以同时筛选多个肿瘤标志物，可广泛应用于肿瘤筛查；对无症状人群进行快速筛查；对危险人群进行动态监测；为良恶性肿瘤的鉴别诊断提供依据；还能用于肿瘤治疗效果的观察和评价；为临床提供更多的指标，提高辅助诊断的准确率。
与肿瘤标志物发现所用的芯片不同，用于肿瘤早期筛查及辅助诊断的蛋白芯片点样不多，主要是检测一些非常明确的、具备诊断价值的蛋白分子。例如我国批准的多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统（protein chip system for multi-tumor marker detection），筛查的肿瘤标志物有AFP、NSE、PSA、free-PSA、CEA、CA125、CA242、CA15-3、CA19-9、β-HCG、Ferritin和HGH共12种，可用于原发性肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结/直肠癌和乳腺癌的早期筛查。
但是，由于各自的反应条件并不完全一致，在检测多种肿瘤标志物中，要采用一种趋同的反应条件，因此就很有可能导致临床上每个体系不能达到最佳的反应条件，也因此无法达到最佳的敏感性条件。也正是这个原因，在一个反应体系中无法有效去除非特异性干扰，从而导致重复性差，敏感性和准确性低，出现假阳性。
液态芯片是一种全新概念的生物芯片。该技术的核心是把微小的聚苯乙烯小球（5.6μm）用荧光染色的方法进行编码（微球的颜色是通过两种荧光染料染色得到的，调节两种荧光染料的比例可以获得100种不同颜色的微球），然后将针对特定检测物的探针、抗原或抗体共价交联在荧光编码的微球上。应用时微量待检样本可以在液相中与微球表面交联的分子进行特异性地结合，在一个反应孔内可以同时完成多达100种不同的生物学反应。最后用Luminex100进行分析，仪器通过两束激光分别识别编码微球和检测微球上报告分子的荧光强度。因为分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，而且可以在一个微量液态反应体系中同时检测多达100个指标。
液态芯片一个反应可以同时检测上百个指标，每个指标可以高达1000～5000个微粒反应，能够极大地降低误差，提高数据的可靠性，而其特殊的检测方法可以在杂交后不需要清洗就直接读数，检测效率也大大高于固相杂交，正是由于这些优势，液态芯片获批成为唯一被美国FDA批准应用于临床诊断的生物芯片，显示出巨大的发展空间与潜力。
（三）组织芯片
组织芯片（tissue chip），又称组织微阵列（tissue microarray），主要用于检测同一种基因或蛋白质在大量的组织或细胞中的表达情况，是一种高通量、大样本、快速的研究工具。其基本原理是将成百上千个不同个体的小组织标本集成在一张固相载体上，结合免疫组织化学（IHC）、核酸原位杂交（ISH）及荧光原位杂交（FISH）等传统的病理学技术，通过特异性探针、芯片杂交和标记染色，在显微镜下获取图像信息，从而可以一次性对成百上千份组织标本的特定基因及蛋白的种类和表达量进行分析，同时可以对基因和蛋白进行组织定位观察，是基因功能研究中一种非常重要的技术。
组织芯片是继基因芯片和蛋白芯片之后出现的又一种重要的生物芯片技术。基因芯片和蛋白芯片分别是以核酸和蛋白为标本，而组织芯片检测的标本是组织。基因芯片和蛋白芯片都是对同一样本进行高通量的基因或蛋白的种类和表达量的研究，而组织芯片可在同一张切片上同时获得成百上千份组织标本的组织学、基因和蛋白的表达信息。通过组织芯片，研究者可以同时有效地利用大量的组织标本来研究特定基因及其蛋白质在疾病中所起的作用，对于疾病的分子诊断、分子靶标的筛选及治疗效果的预测等方面都具有重要的实用价值。
组织芯片根据不同的制作方法分为石蜡包埋组织芯片和冰冻组织芯片。石蜡包埋组织芯片制作比较简单，缺点是用甲醛溶液固定组织的固定方法及时间对核酸原位杂交实验的特异性和敏感性有较大影响；冰冻组织芯片是以新鲜组织为材料，能够保护组织细胞中的抗原，具有较高的敏感性，且操作时间短，但是制作过程较为困难。
组织芯片以肿瘤病理组织为检测样本，可同时在DNA、mRNA、蛋白质和组织形态学水平对分子标志物进行研究，在肿瘤组织的大规模、平行化的生物标志物筛选中显示了巨大的潜能。组织芯片与基因芯片和蛋白芯片配合使用，在筛选肿瘤标志物过程中有很好的互补作用。利用基因芯片和蛋白芯片筛选出候选的基因，再通过组织芯片在大量的病理组织中对候选基因进行评价和验证。组织芯片能够在实验条件高度一致的情况下高效、高通量鉴定基因芯片和蛋白芯片筛选出来的候选标志基因及其产物，促使了从基础到临床的转化。
（四）糖芯片
糖芯片由少量多种类的天然或合成的低聚糖组成。利用这种芯片能对肿瘤的糖标志物进行筛选。肿瘤相关碳水化合物抗原（TACA）表达在肿瘤组织的碳水化合物结构。与健康组织相比，TACA在肿瘤的特异性或显著增强。Globo系列神经节苷脂，特别是Globo-H和阶段特异性胚胎抗原3和4（SSEA-3/4）是研究较多的TACA之一。多糖阵列显示乳腺癌患者Globo-H的抗体水平升高，具有以血清抗体为基础乳腺癌筛查的潜力。而同样的聚糖阵列被用来检测肺癌的单克隆抗体，从而用于肺癌的筛查。
三、小结
生物芯片具有通量高、微型化的特点，可以对多个样本进行平行检测，并且样本用量极小，能够广泛用于肿瘤标志物的发现及临床筛查。尽管新一代测序的出现使生物芯片在临床检测上的应用受到了挑战，但是由于生物芯片分析简单、可重复性好，仍然具备不可替代的地位。蛋白质芯片是生物芯片中临床应用最明确的，已经用于肿瘤的早期筛查，而DNA芯片、组织芯片和糖芯片还处于实验室研究阶段，主要还是应用于肿瘤标志物的发现上。总之，生物芯片在肿瘤标志物的发现及临床早期筛查中具有重要的应用价值。
（苏海翔，李郁）