第四节　基因疗法在角膜疾病防治中的应用

与传统治疗方法相比，基因疗法更能够从根源上解决问题。在过去的20年间，基因治疗在眼科领域取得了惊人的成功。尤其是视网膜色素上皮细胞的基因替代疗法在恢复Leber先天性黑矇患者视力方面取得了突破性进展，充分说明了基因疗法在预防和治疗眼病方面的潜力。

角膜是基因治疗的理想组织，因为它较容易获得，且具有相对的免疫赦免性。角膜是一种透明组织，没有血管，因此可以很容易地对其进行观察随访。因为角膜可以在培养基中长期保存，所以尤其适合采用体外基因治疗策略。目前已有多种体外基因干预的方法将基因运输到角膜组织中，如采用腺病毒、腺相关病毒（AAV）、逆转录病毒和慢病毒载体，或采用质粒DNA、脂质、聚合物和纳米颗粒在内的非病毒载体，或采用各种物理技术，如局部给药、基因枪、电穿孔、基质内注射和离子导入等。然而这些技术的效果都不甚理想，每种都有其优点和缺点。

一、角膜的基因治疗工具

（一）病毒载体

病毒是应用最广泛的一种基因载体工具。在约70%的基因治疗临床研究中，病毒载体会被使用。研究证实，腺病毒（AV）、腺相关病毒（AAV）、逆转录病毒和慢病毒均能有效地将基因运输到角膜中。然而，这些病毒载体又有其各自的局限性。腺病毒和逆转录病毒适合在各种程度的角膜炎症反应时使用，可以在短时间内成功地将基因传递到处于分裂的角膜细胞中。然而，这两种载体能转染低分裂或非分裂的细胞，如角膜内皮细胞和角膜细胞。AAV和缺陷型慢病毒载体能够转染慢分裂或不分裂的细胞，并且能够提供长期的转基因表达，可以用于角膜细胞和内皮细胞的基因导入。然而，慢病毒载体来自马传染性贫血病毒和人类免疫缺陷病毒，因此人们不易接受将其作为病毒载体在人体上应用。AAV因其效力和安全性而成为角膜基因治疗的良好选择。重组AAV载体在眼部基因治疗和恢复视力方面有很大的应用前景。

1.腺病毒

目前，第三代AV载体能够携带更大的基因插入物，免疫源性较低，但需要辅助病毒。为了减少辅助病毒污染，需要使用Cre/loxP系统和经过重组酶稳定转染的293个细胞。这样可以使辅助病毒污染降率降低到<0.01%。然而，由于临床上需要大剂量使用，因此辅助病毒污染的问题仍然需要引起关注。近年来，已有研究证实在巨细胞病毒即刻早期启动子（CMV）的控制下，AV载体能成功将基因导入小鼠角膜基质和内皮细胞。但是由于AV载体提供转基因表达是短期的，尽管相对副作用较少，仍然限制了其在遗传基因缺陷性疾病的长期治疗中应用。

2.腺相关病毒

在110种已知的血清型AAV中，迄今只有1～10种血清型用于基因治疗。AAV载体在视网膜、角膜和许多体内的非眼部组织中具有较高的转导效率和长期转基因表达。传统AAV载体中以AAV2的应用最为广泛，相关研究也最为深入。近年来，研究发现AAV不同血清型的不同衣壳结构使每个血清型能够结合不同的细胞表面受体。例如，AAV血清型4、5和6利用唾液酸，而AAV 8和9使用层粘连蛋白受体进入细胞。鉴于每种血清型AAV对各种细胞/组织都显示出独特的转导模式，从而产生了新一代的具有针对性的杂交AAV载体，即通过将AAV1～9的衣壳转移AAV2基因组，使其具有各种独特的转导功能。这些杂交载体AAV2/1～9在各种动物模型的眼部组织中显示出比AAV2/2更大的转导效率。值得注意的是，在使用各种杂交重组AAV载体进行的研究中，观察到在转导效率、组织偏好、首次转基因出现时间和持续时间方面存在很大差异。研究证实AAV2/7和2/8在视网膜和前房组织包括虹膜、小梁网和角膜中均具有优越的长期转导能力（最长可达6个月）。在角膜组织中，AAV2/6的转导效率比AAV2/8或AAV2/9高30～50倍。此外一个重要的发现是，没有一种被测试的AAV血清型导致细胞明显死亡或细胞活力丧失，再次证明AAV载体对角膜是安全的。当然，以上发现需要对其在活体角膜的转导效果进行更深入的研究验证。

3.逆转录病毒和慢病毒

近年来，对逆转录病毒和慢病毒的研发和检查也取得了一定的进展。逆转录病毒载体是通过删除逆转录病毒和慢病毒的大多数不需要的基因而产生的，这个降低复制风险的过程可以通过技术方法实现，以人类免疫缺陷病毒（HIV）为代表的慢病毒载体对组织细胞基因组的毒性影响似乎小于逆转录病毒。

（二）非病毒载体

在有些研究中，非病毒载体成功的用于将表达治疗性基因的质粒DNA引入靶细胞。非病毒载体由于毒性低、免疫原性和致病性，被认为比病毒载体更安全。此外，质粒载体具有更高的直接效益。然而，非病毒载体转染效率低是其一个重大的挑战。近年来，一些新的策略已经被开发出来。

1.微注射技术

目前已经有一些研究通过微注射质粒的方法，成功将绿色荧光蛋白、白细胞介素18、抗血管内皮生长因子受体、内皮抑素、基质金属蛋白酶14、血管生成抑制蛋白导入到角膜的多种细胞中。针对角膜不同层的显微注射已经在眼部不同的解剖位置中进行，包括基质内、结膜下和直接进入前房等。基质内注射可能是治疗急性角膜疾病的合适方法，因为在基质内注射后角膜中即可检测到短期的基因表达。相反，结膜下注射显示出了长期稳定的转基因表达，并可能有助于避免眼内注射引起的眼内炎和白内障形成。

2.电穿孔

电穿孔，又称基因电疗法或电渗透，是利用高强度电脉冲在细胞膜上形成瞬态孔隙并使基因导入，可以在培养的眼部组织和细胞中使用。其优点之一是可以将大的DNA结构运输到细胞中。目前关于电穿孔的研究报道还很少。有研究证实，电穿孔能够将外来基因导入角膜上皮细胞和角质细胞中。200V/cm的电流不会引起外伤性损伤、角膜水肿或炎症，但转入基因的水平较低；较高的电流能够增强基因转入，但也导致相当大的角膜损伤。电流可以造成不可逆的组织损伤，包括热损伤和Ca2+流入。最近的研究发现，离子电泳的基因导入效率更高，而离子电泳与电穿孔联合使用比两种方法单独使用更有效。

3.声孔效应

声孔效应是利用超声波在质膜中产生孔隙，将DNA转入细胞核。该技术对转染离体和活体的细胞均有效，而其转染效率取决于超声处理的换能器频率、声压、输出强度和脉冲持续时间，以及微泡等对比剂的使用。靶向超声下的微泡破坏技术作为一种新型特异性基因转移方法具有很大研究和应用潜力，目前已成功用于离体人和大鼠视网膜色素上皮细胞（RPE）细胞的AAV基因转染。微气泡通常直径约3μm，由一个装有气体核心的外壳组成。市场上可以买到的微气泡在外壳成分（如白蛋白、半乳糖、脂质、聚合物）和气体核心（如空气、全氟碳化合物、氮）上有所不同。微气泡的一个显著优势是，它们能对特定的目标区域起作用，但其确切的作用机制尚不清楚，推测可能是由于壳碎片诱导的细胞微孔、高速压力射流、热和自由基产生所带来的微环境变化导致。已有研究证实，超声和微泡可显著提高角膜细胞的转染效力，且未见组织损伤。然而，微泡使用的多重安全问题，包括血清中的不稳定性和人体白蛋白等成分的感染风险，限制了微泡的使用。

4.基因枪

基因枪是一种弹道式基因转移方法，是利用微米大小的生物惰性重金属（金、银或钨）颗粒和机械或大型弹丸（向心力、磁或静电）快速轰击细胞/组织，使包裹了DNA的颗粒转移到细胞内。基因枪传递基因的效力取决于许多因素，如包裹了DNA的颗粒、温度、细胞的数量，力度等。目前已有用基因枪在角膜中成功传递基因的报道。

5.可控性角膜脱水

在去除上皮细胞后，通过烘干器，控制角膜脱水可增加小鼠和兔角膜在体内和人角膜体外的载体吸收。当然，过度脱水可能会对角膜完整性造成负面影响。研究显示，在角膜干燥后50秒内检测到显著较高的转基因递送量，但角膜形态学有了一定变化；干燥30秒后也观察到高转基因递送，但不影响角膜形态学；干燥10秒或20秒后观察到了中度转基因递送，角膜形态学无改变。这项研究表明，控制角膜干燥可以调节角膜内的基因传递。

6.激光

近期有研究报道了一种利用飞秒激光将基因导入猪角膜的基质袋技术。用飞秒激光制备了110μm深度的基质袋，并注射了表达GFP的慢病毒载体。载体应用5天后进行的角膜组织学检查显示，在角膜袋周围的细胞中有标记基因表达，并持续了3周。

7.化学物质

数十种天然合成的化学物质被用于角膜细胞的基因导入，如；二烯丙基三甲基氯化铵（DOTMA）、二油酸磷脂酰乙醇酰胺（DOPE）、1，2-二烯丙基-3-三甲基铵-丙烷（DOTAP）、二甲基十八烷基溴化铵（DDAB）、3β-［N-（N’，N’-二甲氨基乙烷）氨甲酰］胆固醇、N-甲基-4（二烯基）甲基吡啶氯化物等。

二、基因治疗在各种角膜病变中应用进展

基因疗法在治疗和预防角膜疾病和眼表疾病方面有很大的前景。在角膜基因治疗领域，基因治疗的重点是治疗常见的角膜疾病而不是治疗遗传缺陷。

（一）角膜移植排斥

角膜移植术目前用于治疗许多角膜疾病。尽管角膜具有免疫赦免，但免疫反应引起的角膜移植排斥反应仍然是失败的主要原因。基因治疗可以通过传递各种基因来调节体内细胞运输、凋亡、血管生成和伤口愈合，从而提高同种异体移植物的存活率。

（二）角膜瘢痕及伤口愈合

伤口愈合在维持角膜透明度和正常视力方面起着重要作用。目前基因治疗的一个主要目标是防止转化生长因子-β（TGF-β）所致的角膜瘢痕和其他角膜疾病。核心蛋白聚糖（Decorin）是一种在角膜基质中表达的小的富含亮氨酸蛋白多糖家族的成员，在角膜的伤口愈合和结构支持中起着重要的作用。离体研究显示，人类角膜成纤维细胞表达的Decorin能显著抑制TGF-β引起的角膜细胞分化。此外，也有研究采用AAV介导的去修饰基因能有效减少体内角膜瘢痕形成。

（三）角膜新生血管化

角膜缘角膜新生血管的萌发与炎症反应密切相关，是角膜同种异体排斥反应的主要危险因素。新血管的形成和回归的机制非常复杂，涉及细胞因子、生长因子和细胞类型。然而，血管内皮生长因子（VEGF）在新血管的发育过程中起着关键性的作用，这一点已被广泛接受。多项研究通过实验模型和以VEGF为靶点的不同转染基因来阻止角膜血管生成，取得了较好的结果。此外，使用内皮抑素的基因治疗策略在治疗角膜新生血管方面也显示出希望。内皮抑素是胶原蛋白的天然片段，可以阻断内皮细胞的黏附、迁移和增殖，抑制细胞凋亡。研究证实，经单次结膜下注射重组AAV导入内皮抑素能够对角膜血管生成有明显抑制作用。

（四）其他角膜疾病

由眼部单纯疱疹病毒（HSV）感染引起的单纯疱疹病毒性角膜炎（HSK）是发达国家感染性失明的主要原因。许多研究的共同目标是开发一种使用基因转移技术的HSV角膜炎疫苗，使眼部抵抗HSV的能力加强。

（五）未来发展前景

近年来，角膜基因治疗领域取得了长足的进展，但大部分的角膜基因治疗研究都是在动物身上完成的，临床研究很少，在临床应用于人类患者的基因治疗方面远远落后于视网膜。随着对分子机制和遗传及获得性角膜疾病过程的理解的加深，以基因为靶点的治疗正逐渐成为可能。我们看到，各种病毒载体和非病毒载体的检测和多种传递系统在各种角膜疾病模型中逐渐起到关键作用。因为多项角膜基因治疗新技术已经在动物模型（如兔、鼠等）中被证明是有效的，而这些动物模型在解剖学、伤口愈合反应和功能方面与人类角膜非常相似，因此，我们相信角膜基因治疗的未来是光明的。随着人类角膜疾病的动物模型的发现以及基因治疗方法与干细胞治疗和再生医学的结合，治疗角膜盲的方法很可能在未来成为现实。

（王萌萌　张铭连）