第二节　双孢菇菌种生产

菌种是双孢菇栽培的基础条件，就像农作物的种子一样，只有选用优良的菌种，才能保证稳产高产，获得良好的栽培效益。如果没有优良的菌种，再好的栽培技术也不可能得到理想的经济效益；反之，如果有高产的良种，加上科学的生产管理，则可以达到事半功倍的效果。为了规范我国双孢菇菌种生产、经销和使用，确保我国双孢菇生产健康发展，我国制定了国家标准《双孢菇菌种》（GB19171—2003），菌种生产经营单位都应严格遵照该标准执行。优良的菌种应该具有种性好、纯度高及菌龄适宜等特征。

1. 种性好

是要求菌种本身具有理想的遗传性状。例如，子实体白色；菌盖光滑、圆整，顶部微凸；菌盖和菌柄呈合适的比例，符合审美要求；菇体结实，密度较大，菌盖与菌柄结合紧密，不易脱落；大小适中，菌盖直径3.0～5.0cm；对环境适应性强，高产稳产；对大多数病虫害具有很高的抵抗能力；具有较长的货架寿命。

2. 纯度高

是指菌种生产过程中严格按照操作规程进行，防止其他有害微生物的侵染，保证菌种中不隐藏任何有害生物。

3. 菌龄适宜

是要求菌种在生活力最强的时期用于扩接下一级菌种或用于栽培生产。

一、菌种的概念

菌种是人工培育的纯菌丝体及其培养基的混合体。按母种、原种、栽培种三级扩大繁育程序培育双孢菇菌种。双孢菇产生的真正种子是孢子，但由于孢子是经过基因重组后的产物，后代与亲本相比会发生变异，而且孢子在储藏一段时间后萌发率降低，所以，在双孢菇生产中一般不用孢子作为菌种。双孢菇菌丝片段具有很强的再生能力，所以栽培双孢菇和其他食用菌一样，一般采用菌丝体作为菌种。

二、菌种的分级

根据菌种扩繁程序，把菌种分为母种、原种和栽培种三级，即母种扩接制备原种、原种扩接制备栽培种。其主要目的是为了实现菌种数量的扩大，以满足生产对菌种的需要，同时增加菌种对培养料的适应性。

1. 母种

通常把试管培养的菌种称为母种或一级菌种，它是由双孢菇的子实体组织分离或孢子分离，在含有琼脂的培养基上培育生长的具有结实能力的纯菌丝体，培养容器一般为玻璃试管，常用于扩大培养或用于菌种保藏。直接用组织分离或孢子分离培养而成的母种叫原始母种，原始母种转扩1次而成的母种称为一级母种，一级母种再转扩1次而成的母种称为二级母种，生产上常用三级或四级母种作为生产用母种。如果过多的转接和培养，可能会导致菌种退化，故生产中使用的母种转代次数不宜过多（图1-3）。

2. 原种

又称二级种。是将母种接种到粪草、棉籽壳或者麦粒培养基上培养获得的具有结实能力的菌丝体及培养基质，培养用的容器一般为玻璃或塑料制成的菌种瓶。通常1支母种可以转接5瓶原种，原种可以用来扩接栽培种（图1-4）。

3. 栽培种

又称三级种或生产种。是将原种接种到粪草、棉籽壳或者麦粒培养基上培养获得的具有结实能力的菌丝体及培养基质，国内培养用的容器一般为玻璃或塑料制成的菌种瓶或小塑料袋，国外多采用容量较大的塑料袋。通常1瓶原种可以接种30瓶栽培种，栽培种直接用于栽培，每平方米栽培面积用种1.5～2瓶（图1-5）。

三、菌种的生产流程

不论哪一级菌种，生产工艺大致相同，都包括培养基的制备、接种和培养三个主要环节。

1. 母种生产工艺流程

马铃薯葡萄糖琼脂培养基→分装试管→121℃灭菌0.5h→摆斜面培养基→接种培养。

2. 原种生产工艺流程

粪草、棉籽壳或麦粒培养基→装瓶→126℃灭菌2h→接种培养。

3. 栽培种生产工艺流程

粪草、棉籽壳或麦粒培养基→装瓶或装袋→126℃灭菌2h→接种培养。

四、菌种的生产计划

菌种生产季节应根据当地适合栽培双孢菇的时间而定，在外界环境条件正常的情况下，一般应在开始栽培前30～40天安排生产栽培种，在生产栽培种前30～40天生产原种，在生产原种前15～20天购买或生产母种。菌种生产时间非常重要，一定要按照菌种生产计划严格执行。菌种生产多少也应进行周密计划，由双孢菇的栽培数量来定。一般每平方米床面可用栽培种1.5瓶（500ml高压玻璃瓶装），1瓶原种可接栽培种20～30袋或40～50瓶，每支试管母种可接原种5瓶。可按照此比例计算出母种、原种、栽培种的数量。在生产中，栽培种应多制一些，以留有生产余地。

因双孢菇是中温性菇类，受环境条件的制约，栽培前严格制订菌种生产计划，并严格执行。如以9月上旬播种为例，菌种生产计划为6月初制作生产用母种→7月初开始生产原种→8月初生产栽培种→9月初栽培种培养好→9月上旬播种。

五、优质菌种的标准

宏观检查菌种质量的方法可概括为“纯、正、壮、润、香”五个字。“纯”指菌种的纯度高，无杂菌感染、无抑制线、无退菌现象等；“正”指菌丝无异常，具有亲本的特征，如菌丝纯白、有光泽，生长整齐，连接成块，具弹性等；“壮”指菌丝粗壮、生长旺盛、分枝多而密，在培养基上萌发、定植、蔓延速度快；“润”指菌种基质湿润，与瓶壁紧贴，瓶颈略有水珠，无干缩、松散现象；“香”是指具该品种特有的香味，无霉变、腥臭、酸败气味。

1. 优质母种的标准

用肉眼直接观察斜面菌丝，在同一种培养基上具有原菌株的菌落形态特征，若菌丝呈洁白放射状，且生长浓密、生长健壮有力、边缘整齐、无间断，无病虫杂菌污染，气生菌丝爬壁力强，不发黄，培养基无萎缩现象，接种点无菌丝退化和自溶现象者为合格菌种。菌龄掌握在刚长满斜面即用于扩接原种或继代培养。

凡发现红、黄、绿、黑等杂菌危害斑块或有明显抑制线的污染菌种，应坚决抛弃不用。母种质量感官要求标准见表1-1。

2. 优质原种及栽培种的标准

优质菌种应当菌丝致密、洁白、粗壮有力，料面气生菌丝整齐均匀，瓶壁四周菌丝爬壁力强，无间断，无杂菌污染。菌龄35～40天时，菌丝应长满瓶或袋，颜色一致，无不均匀斑，不萎缩，不发黄，菌龄掌握在菌丝长满后7～10天使用。如有菌被产生，说明过湿；上下不均匀，说明预湿不佳；如菌丝黄褐色、蜘蛛状，说明培养温度过高。如培养料干缩，脱离瓶壁，并出现黄色积液时，则表明菌种已老化，应予淘汰。

菌种的质量直接关系到双孢菇栽培的成败及栽培者经济效益的高低。在进行栽培前，一定要认真检查菌种的质量，挑出不合格菌种，严把菌种质量关，以确保栽培成功。

菌种的质量检测除以上感官鉴定外，还应进行小面积的出菇试验。用塑料筐或泡沫箱等装入堆制好的培养料或发好菌丝的培养料，通过接入菌种或覆土，观察其发菌或出菇快慢、原基的形成数量、抗杂能力、子实体的形态、生物学转化率等，凡出菇快、整齐、抗性强、产量高的均为优良菌种。原种与栽培种感官质量要求标准见表1-2、表1-3。

六、主要栽培品种

（一）品种类型

双孢菇根据菇盖颜色分为白色和棕色两种，当前生产上栽培的主要以白色双孢菇品种为主。双孢菇根据生产方式的适应性分为非工厂化生产用品种和工厂化生产专用品种两种，非工厂化生产用品种主要包括通过国家食用菌品种认定的6个品种及引进的菌株U3等。

（二）主要栽培品种特征特性

下面以通过国家食用菌品种认定委员会认定的品种为主。

1. 白色双孢菇（图1-6，彩图）

（1）As2796　As2796由福建省农业科学院食用菌研究所和福建省蘑菇菌种研究推广站育成，于1993年通过福建省蘑菇菌种审定委员会审定，于2007年通过国家食用菌品种认定委员会认定，认定编号为“国品认菌2007036”。

①特征特性。子实体单生。菌盖直径3.0～3.5cm，厚度2.0～2.5cm，外形圆整，组织结实，色泽洁白，无鳞片；菌柄白色，中生，直短，直径1.0～1.5cm，长度与直径比为（1～1.2）∶1，长度与菌盖直径比为1∶（2.0～2.5），无绒毛和鳞片；菌紧密、细小、色淡。要求基质含水量65%～68%，含氮量1.4%～1.6%，pH7左右；栽培中发菌温度24～28℃。栽培中菌丝可耐受最高温度35℃，子实体可耐受最高温度24℃，转潮不明显，后劲强。菌种播种后萌发力强，菌丝吃料速度中等偏快。菌丝爬土速度中等偏快，扭结能力强，扭结发育成菇蕾或膨大为合格菇的时间较长，因此开采时间比一般菌株迟3天左右。成菇率90%以上，商品率80%以上。1～4潮产量分布均匀，有利加工厂生产。

②产量表现。产量为9～15kg/m²，生物学效率35%～45%（工厂化可达20～30kg/m²）。

③栽培技术要点。各产区可根据当地适宜气候确定播种时间，福建为9～12月。投料量每平方米30～35kg，碳氮比为（28～30）∶1，正常管理的喷水量不少于高产菌株。气温超过22℃，甚至达到24℃时一般不死菇，可比一般菌株提前15天左右栽培。注意不宜薄料栽培，料含氮量太低或水分不足都会影响产量或产生薄菇和空腹菇。

（2）As4607　As4607由福建省农业科学院食用菌研究所和福建省蘑菇菌种研究推广站育成，于1997年通过福建省蘑菇菌种审定委员会审定，于2007年通过国家食用菌品种认定委员会认定，认定编号为“国品认菌2007035”。

①特征特性。子实体单生。商品菇直径3.2～3.8cm，菌盖厚2.0～2.5cm，外形圆整，组织结实，色泽洁白，无鳞片；菌柄直短，直径1.0～1.5cm，长度与直径比（1～1.2）∶1，长度与菌盖直径比1∶（2.0～2.5），无绒毛和鳞片；菌褶紧密，细小，色淡。转潮不明显，后劲强。菌种播种后萌发力强，菌丝吃料速度和爬土速度中等偏快，扭结能力强，扭结发育成菇蕾或膨大为商品菇的时间较长，因此开采时间比一般菌株迟1～2天。1～4潮产量分布较均匀，有利加工厂生产。

②产量表现。产量为9～15kg/m²，生物学效率35%～45%。

③栽培技术要点。各产区可根据当地适宜气候确定播种时间，福建为9～12月。投料量每平方米30～35kg，碳氮比为（28～30）∶1，含氮量1.4%～1.6%，含水量65%～68%，pH在7.0左右。发菌适温24～28℃，适宜空气相对湿度85%～90%；出菇温度10～24℃，最适温度14～22℃。注意不宜薄料栽培，料含氮量太低或水分不足都会影响产量或产生薄菇和空腹菇。

（3）英秀1号　英秀1号由浙江省农业科学院园艺研究所育成，于2007年通过国家食用菌品种认定委员会认定，认定编号为“国品认菌2007037”。

①特征特性。子实体散生，少量丛生，近半球形，不凹顶。商品菇菌盖白色，平均直径4.1cm，菌盖平均厚1.7cm，表面光洁，环境干燥时表面有鳞片；菌柄白色，粗短，近圆柱形，基部膨大明显，平均长2.6cm，中部平均直径1.5cm。子实体组织致密结实。发菌适温22～26℃，原基形成不需温差刺激，子实体生长发育温度4～23℃，最适温度16～18℃；低温结实能力强。菇潮间隔期7～10天。

②产量表现。产量为9.1～15.7kg/m²。

③栽培技术要点。堆肥适宜含氮量为1.5%～1.7%，合成堆肥发酵前的适宜含氮量为1.6%～1.8%，二次发酵后的培养料适宜含水量为65%左右，pH 7.2～7.5。出菇期适宜室温13～18℃，温度高于20℃时禁止喷水，加强通风。自然气候条件下秋冬季播种，春季结束，跨年度栽培。河北、河南、山东、山西、安徽和苏北等蘑菇产区适宜播种期为8月，浙江、上海及苏南蘑菇产区适宜播种期为9月，福建、广东、广西等蘑菇产区适宜播种期为10～11月。应用菇棚覆膜增温技术措施，可适当推迟播种期，实现反季节栽培。要充分利用低温出菇能力强的特性，使其在自然温度较低季节大量出菇。适当提高培养基含水量，有利于提高产量。注意预防高温烧菌和死菇；出菇期应保持覆土良好的湿度和空气相对湿度，以免菇盖产生鳞片。

（4）蘑菇176　蘑菇176供种单位为上海市农业科学院食用菌研究所，于2004年通过上海市农作物品种审定委员会审定，于2008年通过国家食用菌品种认定委员会认定，认定编号为“国品认菌2008030”。

①特征特性。子实体单生、丛生，半球形。菌盖大小3.5～4.5cm，菌盖厚1.9～2.3cm，菌盖色白，表面光滑；菌柄长2.8～3.6cm，粗1.9～2.5cm；菌丝生长温度为20～30℃，菌丝在pH 5～8时均能生长；发菌期为20～25天，从播种到出菇需35～45天；原基形成温度10～20℃，菌丝体生长最适温度24～28℃；子实体适宜生长温度10～20℃，出菇潮次明显，7天左右一潮菇。

②产量表现。生物学效率40%左右，每平方米产鲜菇8～13.5kg。

③栽培技术要点。以稻草为主料时，每平方米用稻草20kg、干牛粪4kg、豆饼粉0.32kg（或菜饼0.5kg）、米糠0.6kg、磷肥0.6kg、尿素0.075kg、硫酸铵0.25kg、石膏0.2kg、石灰0.65kg；以麦草为主料时，每平方米用麦草15kg、干牛粪2kg、豆饼粉0.5kg（或菜饼0.8kg）、尿素0.18kg、酸铵0.2kg、磷肥0.6kg、石膏0.5kg、石灰0.4kg。上海地区播种期9月5～10日，其余地区提早2～3天播种。培养料含水量65%～68%，必须进行二次发酵，发菌期控温24～28℃。当菌丝穿透料底时，进行覆土，覆土后发菌温度控制在24～28℃，保持土层湿润。菌丝长满覆土层时进行通风或喷水降温，降温到10～20℃，最适温度在15℃左右。出菇期及时喷出菇水，多次喷湿，温度控制在10～20℃，空气湿度90%左右。及时采收，做好残根清理和补土、补水工作。

（5）U3　U3由福建省农业科学院食用菌研究所和福建省蘑菇菌种研究推广站引自荷兰。其特征特性、产量表现和栽培技术要点与蘑菇176类似。

（6）A15与F56　A15与F56为工厂化生产专用菌株，分别引自美国和法国，工厂化栽培产量可达20～30kg/m²，其特征特性和栽培技术要点与蘑菇176类似。

2. 棕色双孢菇（图1-7，彩图）

（1）棕秀1号。棕秀1号是由浙江省农业科学院园艺研究所育成的双孢菇品种，于2007年通过国家食用菌品种认定委员会认定，认定编号为“国品认菌2007038”。

①特征特性。子实体散生，少量丛生，近半球形，不凹顶。菇柄粗短、白色，近圆柱形，基部稍膨大，平均长2.8cm，菌柄中部平均直径1.5cm。商品菇菌盖棕褐色，平均厚1.8cm，内部菌肉白色，肉质紧密，平均直径4.1cm，表面光洁。环境干燥时菇盖表面有鳞片产生。原基形成不需要温差刺激，菌丝生长温度5～33℃，发菌期适宜温度22～26℃；子实体生长发育温度4～23℃，最适温度16～18℃；低温结实能力强。

②产量表现。产量为9.8～16.5kg/m²。

③栽培技术要点。自然气候条件下秋冬季播种，可比常规品种延后10～25天播种，跨年度栽培。河北、河南、山东、山西、安徽和苏北等蘑菇产区适宜播种期为8月，江苏、浙江、上海蘑菇产区播种期以9月为好；华南蘑菇产区适当推迟，福建、广东、广西等蘑菇产区适宜播种期为10～11月。应用菇棚覆膜增温技术措施，播种期可推迟，实现反季节栽培。粪草培养料的适宜含氮量为1.5%～1.7%，无粪合成料发酵前的适宜含氮量为1.6%～1.8%，碳氮比为（30～33）∶1，二次发酵后的培养料适宜含水量为65%左右，pH在7.2～7.5。发菌期如料温高于28℃，应在夜间温度低时进行通风降温，必要时需向料层打扦，散发料内的热量，降低料温，以防“烧菌”；出菇期菇房内温度控制在13～18℃，空气相对湿度应保持在85%～90%，以利于子实体形成和生长发育。

（2）棕蘑1号　棕蘑1号供种单位为上海市农业科学院食用菌研究所，于2004年通过上海市农作物品种审定委员会审定，于2008年通过国家食用菌品种认定委员会认定，认定编号为“国品认菌2008032”。

①特征特性。子实体以单生为主。菇形圆整，质地坚实紧密；朵型中等，不开伞直径在3～5cm；适当疏蕾，可获得菌盖直径10～12cm的开伞子实体；菌盖呈棕色，无鳞片；菌柄着生于菌盖的中部；潮次明显，转潮快；菌丝最适生长温度为25℃左右，最适出菇温度为16～18℃。

②产量表现。每平方米产鲜菇8～10kg。

③栽培技术要点。上海及周边地区一般在8月中上旬进行培养料堆制，9月中上旬播种，10月上旬覆土；出菇气温维持在10～20℃，一般出菇期可从当年10月下旬到翌年4月下旬。建议进行二次发酵，发菌温度25℃左右，覆土厚度4cm左右；出菇温度16～18℃，一潮菇喷一次水，避免在原基形成期喷水，当菇体长至黄豆大时，可采用轻喷勤喷的方法喷水。

七、双孢菇母种生产

双孢菇母种的生产包括培养基的制作和母种的扩繁。制备母种培养基基本程序为制作培养基→各种药品的称量→配制→制取（水煮、过滤）→分装→灭菌→冷却→灭菌效果的检查。母种的扩繁是利用食用菌菌丝生长的无限性和营养生长过程很少发生变异这两个特点而实施的。从理论上讲，只要有适于其生长的营养和环境条件，菌丝就可无限地生长，而且由于其生长过程中没有发生有性繁殖，几乎不发生遗传的变异。当然，这并不排除在营养生长的漫长时间进程中发生菌种的退化和老化。转管次数越多，发生退化和老化的可能性越大，因此要严格控制转管次数。菇农没有经验或未经专门训练情况下，不自行母种扩繁或尽量减少扩繁和转管次数，以防菌种退化和老化。母种扩繁的基本程序为母种试管的表面处理→接种→培养→检查→淘汰被污染和不正常个体→成品。

（一）母种培养基常用配方

①马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂18～20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，pH6.5～7.0，水1000ml。

②马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，琼脂18～20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，pH6.5～7.0，水1000ml。

③马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，干牛粪50g，琼脂18～20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，pH6.5～7.0，水1000ml。

化学试剂类原料如葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾等，要使用化学纯以上级别的试剂，生物制剂如蛋白胨，天然材料如马铃薯、麦麸等，要求新鲜、无虫、无螨、无霉、干燥。PDA基础上，1000ml培养基加5g蛋白胨（或50g干牛粪）可以复壮菌丝。

（二）母种生产方法

1. 切土豆、称药品及原料

将土豆洗净、去皮、挖去芽眼（芽眼处龙葵碱对菌丝有毒害作用），切成1cm左右小块，准确称取各种药品及原料（图1-8～图1-11）。　

2. 煮土豆、溶解药品、调节pH

将200g土豆在1200ml水中文火煮沸30min（标准为熟而不烂），然后用6层纱布过滤，倒掉残渣并洗净铝锅。将滤液倒入锅内，同时加入溶解的琼脂粉（如用琼脂条，事先用清水洗净，剪成1～2cm长小段，以便融化）、称好的葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，继续加热并搅拌至全部溶化，停止加热，将水补足1000ml。如加入蛋白胨需将蛋白胨用冷水溶化后加入，避免蛋白胨因结块而分散不均。在一般情况下，培养基原有的酸碱度基本合适，一般pH为7左右。如果pH偏碱，滴入少量1%柠檬酸，如果偏酸，则滴入1%的氢氧化钠。配制时的酸碱度要略高于使用时所需的适宜酸碱度，一般高压灭菌30min的培养基pH值下降0.1～0.3（图1-12～图1-17）。

3. 分装试管、塞棉塞、包牛皮纸

（1）试管规格　一般选用18mm×180mm或20mm×200mm的试管。

（2）分装试管　将培养基趁热时尽快分装试管。将下口量杯夹在滴定架上，下接一段乳胶管，用弹簧夹夹住胶管，左手握试管，右手控制培养基流量，使每支试管装量相当于试管长度的1/5～1/4（保藏用多些，生产用少些）。分装时要使导管口深插入试管中下部，不让培养基沾在试管口，否则容易沾在棉花塞上造成污染。一旦试管口附近沾有培养基，待凝固后用接种钩取出，并用潮湿洁净的纱布擦拭干净。

（3）塞棉塞　棉絮可用未经脱脂的原棉，先取一块棉花铺平成方形，然后卷曲成柱状，再将两端向内折成短圆柱状，然后塞入试管内，使棉塞表面与试管壁紧贴不起皱纹，松紧度以用手抓棉塞不脱落为度。棉塞塞入管中部分为1.5～2cm，外露部分约1.5cm。

（4）包牛皮纸　将5～10只试管用粗棉线捆成一捆，管口一端用牛皮纸或防潮纸包好扎紧，主要是防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞和灭菌后防杂菌落入棉塞（图1-18～图1-20）。

4. 灭菌、摆试管、检验

（1）灭菌　将分装好的试管放入高压灭菌锅中进行灭菌，压力到0.05MPa时，打开放气阀放气3～5min，然后关闭，继续加热，121℃维持30min。停火自然降压至零后，打开高压锅盖烘干棉塞，待温度降到80℃时，取出试管（图1-21、图1-22）。

（2）摆试管　将灭菌后的试管趁热放入摆斜面的专用框内，框底部前边支一小木块使之稍倾斜，使框内的试管培养基摆成斜面，一般长度为试管的2/3，培养基上限至少应距棉塞3cm，试管摆成斜面后不宜再行摆动。摆好斜面后在上面盖一保温棉，防止试管冷却过快产生太多的冷凝水（图1-23、图1-24）。

（3）检验　随机抽取10%灭菌试管作为样品，每次抽样数量

不得少于10支，超过100支可以采取两级抽样。在28℃下进行2天的空白培养，经检查确实没有微生物长出的为灭菌合格。如有微生物出现，则灭菌效果不好，不能使用，要再行灭菌后倒出，洗涤试管，重新制备（图1-25、图1-26，彩图）。

5. 接种、培养

（1）接种

①操作场所的处理。接种室在使用前，先要清扫干净，最好用湿拖布进行表面清洁，以防地面灰尘飞扬。用75%的消毒用酒精棉球擦拭操作台面，然后放入待接种的培养基斜面试管，并准备好接种用的75%酒精棉球、75%的消毒用酒精、酒精灯（内装95%的工业酒精）、接种钩、镊子、火柴、皮套等。然后打开紫外线灯，照射30min后关闭。如果使用无臭氧灯，关灯后即可马上接种；如果使用普通紫外线灯，最好关闭灯半小时后再进行接种，以减轻臭氧对人的刺激。如使用无菌操作台在接种前要打开30min，形成无菌环境。

②接种操作。接种人员在进入接种室前，要先用肥皂洗净手，并换上接种专用的干净工作服和拖鞋，携母种进入接种室。进入接种室后，先用75%的酒精棉球擦拭操作台面，然后擦拭双手，特别是手指。完成这一系列的表面消毒后，方可接种。接种的规范程序为点燃酒精灯→在火焰上方拔下母种试管棉塞→用镊子夹取酒精棉球在火焰上方灼烧、擦拭试管口内外→放好待接种的试管→在火焰上灼烧蘸有酒精的接种钩→冷却接种钩→在火焰上方进入母种试管，切取绿豆粒至红豆粒大小一块（长和宽均为2～3mm）带有培养基的菌丝体（接种物）→在火焰上方（不要过火焰）将接种物取出并迅速转入（移接时不要接触试管壁或管口）到待接种的试管斜面中间（菌丝朝上）→在火焰上方同时塞好母种试管的棉塞（把棉塞头的四周在火焰上烧一下，塞入棉塞与管壁紧贴）。这时，一支试管母种接种完毕。如此反复，每支试管内的母种一般可转接15～20支，尽量挑选菌龄短的菌丝块进行生产。切取菌种时注意，如果母种斜面上方比较干，要去掉干皮，不要使用。因干皮部分的菌丝生活力不强，影响以后各级菌种的质量。试管从接种箱取出前，应逐支在试管正面的上方贴上标签，写明菌种编号、接种日期、接种人。

③接种后接种室的处理。接种室每次使用后，要及时清理干净，排出废气，清除废物，台面要用75%酒精棉球擦拭消毒。

④接种操作注意事项。第一，酒精灯火焰要高。影响酒精灯火力大小的因素：一是酒精浓度；二是灯芯。应使用95%的工业酒精，灯芯最好用棉花捻制，并拔出适当的长度。第二，母种试管表面和管口要消毒彻底。母种试管表面、试管口，蓬松的棉塞表面都处于有菌状态，管口又是接种操作的必经之路，因此，一定要在酒精灯火焰上用酒精棉球擦拭、灼烧灭菌，以防污染。第三，因为只有在火焰周围的很小范围的空间才是绝对无菌的，因此拔棉塞、取种、接种及棉塞必须在火焰上方操作。第四，接种钩一定要灼烧彻底。接种钩最好用较薄的金属材料制成，灼烧时烧至红色。并要注意接种钩的灼烧长度，灼烧长度以试管长度为度，当然重点是钩，钩以上部分在火焰上灼烧3～5次即可。第五，接种钩灼烧后要冷却。灼烧的接种钩直接用来切取菌种，一是容易烫死菌种，二是菌种容易沾在钩上，使接种困难。冷却一般在无菌的待接试管上部空间进行。另外，熄灭酒精灯时，要用灯盖盖灭，物体表面不要有可见到的酒精，以免发生火灾。接种操作完毕后，要及时将接种室清理干净，排除接种时酒精燃烧放出的有味气体，关好门窗，打开紫外灯再进行一次消毒处理，以利于以后的使用（图1-27、图1-28）　。

（2）培养　试管从接种箱取出前，应逐支在试管正面的上方贴上标签，写明菌种编号、接种日期，随后把试管置培养箱（室）中培养。培养条件要求清洁、干燥、暗光，培养温度前期25℃，长到一半时22℃，12～15天长满斜面（图1-29、图1-30）。

（3）检查　在培养期间一定要经常检查挑选，而不可长满后再挑选留用。在培养期间主要检查两方面内容：一是肉眼观察生长是否正常，包括形态、生长速度、活力等；二是有无污染，发现污染的母种应及时检出（图1-31、图1-32，彩图）。

6. 双孢菇母种的保藏

引进的菌种或自制的菌种有时不能及时用完，若在外界放置时间过长，会使菌丝老化、失水干燥、生活力下降。再用到生产上，易致杂菌污染，降低栽培成功率。因此，应采取一定的方法保存起来。

（1）斜面低温保藏法　此法为实验室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。具体方法是及时挑选无污染、菌丝健壮生长的斜面菌种，棉塞部分用封口膜将试管口棉塞包扎好，再用牛皮纸包好后用绳扎牢，移至4℃的冰箱中进行保存，并间隔一定时间进行移植培养。采用此方法保藏时，一般为2～3个月转管1次（图1-33～图1-35）。　

（2）麦粒保藏法　麦粒保藏法是一种利用自然基质保藏菌种的方法，此种方法可以储藏1年。具体方法是取无瘪粒、无杂质的小麦淘洗干净，浸泡12～15h，加水煮沸30min，使麦粒胀而不破，捞出沥干。再将碳酸钙、石膏拌入熟麦粒中（麦粒、碳酸钙比例为

10kg∶100g）后装入试管中，装入量以1/4～1/3为宜。然后清洗试管，塞硅胶塞，于0.15MPa条件下灭菌2h，经无菌检查合格后备用。试管基质冷却后接种，在23～25℃条件下培养，及时挑选无污染、菌丝健壮生长的菌种，硅胶塞部分用封口膜封好，再用牛皮纸包好后用绳扎牢，移至4℃冰箱保存（图1-36、图1-37）。

（3）液体石蜡保藏法　液体石蜡要选化学纯的，使用前先在121℃下高压灭菌30min，再将液体石蜡在160℃烘箱中加热1～2h或放置在40～60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层出现乳白色直至变成完全透明无色为止，目的是将高压灭菌时浸入液体石蜡中的水蒸发干净。然后将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管加到长满菌丝的斜面中，液体石蜡的装入量以淹过斜面尖端1cm为宜，之后塞上棉塞（最好将棉塞齐管口剪平，用蜡密封或用橡皮塞封口），放于清洁避光、4℃条件下保存，一般可保藏1～2年。在保存期内应定期检查，发现培养基露出液面，应及时补充灭菌液体石蜡。据试验，在5～28℃下可保存6年。

液体石蜡保存的菌种在使用时，不必倒去石蜡油，使用时只要用接种铲从斜面上铲取一小块菌丝块即可，原管仍可重新封蜡，继续保存。刚从液体石蜡菌种中移出的菌丝体，常沾有较多的石蜡，生长较弱，需再转管1次，方能恢复正常（图1-38、图1-39）。

（4）液氮超低温保藏法　液氮超低温保种是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓿内，将该安瓿放入液氮（-196℃）中进行保藏，由于菌丝体处于-196℃条件下，其代谢降低到完全停止的状态，所以不需定期移植。经过大量的试验证明，液氮保种是菌种长期保藏最有效、最可靠的方法。操作方法如下：第一，将要保藏的菌种制成菌悬液备用；第二，准备安瓿，安瓿经无菌检查后，接入要保藏的菌种；第三，将封好口的安瓿放在冻结器内，以每分钟下降1℃的速度缓慢降温，使保藏品逐步均匀地冻结，直至-35℃，以后冻结速度就不需控制；第四，安瓿冻结后立即放入液氮罐内，瓶盖上连接一条细绳并作记号，以便提出所需的菌种；第五，如果拟取用液氮保存的菌种，可将安瓿取出后立即放入35～40℃的温水中迅速解冻，把菌种移接至适宜的培养基上，置于22～24℃条件下培养即可（图1-40、图1-41）。

（三）注意事项

（1）培养菌种使用透气好的胶皮塞　透气性硅胶塞是制备食用菌母种时替代棉塞的新材料，用试管硅胶塞制备食用菌母种透气性好，效果好，不潮不湿，污染少。由于可反复多次使用，成本也不高（图1-42、图1-43）。

（2）注意放冷气　在灭菌过程中压力到0.05MPa时放冷气1次，防止锅内冷气未排尽造成假压，影响灭菌效果（图1-44、图1-45）。　

（3）试管外面套塑料袋　在灭菌时可以在试管外面套一层塑料袋，用皮套扎好袋口后灭菌，这样能避免棉塞过湿，摆试管时带着塑料袋，接菌时才打开，这样能避免空气中杂菌落在棉塞和试管表面，减少杂菌污染（图1-46、图1-47）。

（4）母种转接　在母种转接时，一般去除母种原接种块部分，并且接种钩要充分冷却后再接种，并且尽量钩在培养基底部，不接触母种菌丝（避免菌丝受到机械损伤），转接到新试管时接种钩尽

量不接触接种处之外的其他部位。接种钩在接种前用报纸包好并装到塑料袋中，等接种时再取出接种，可减少杂菌污染。由于双孢菇菌丝的生长速度较慢，如果时间要求紧迫，可以在一个母种斜面上转接2～3个菌块，长满试管的时间可以缩短1/2。另外，使用钢制酒精灯代替玻璃酒精灯，避免酒精灯爆炸引起危险（图1-48～图1-51）。

（5）母种保藏　母种培养好后应分类保藏在保藏盒中，并注明菌种名称、保存日期及保存人，方便储藏和使用（图1-52、图1-53）。

八、原种、栽培种生产（麦粒菌种的生产）

双孢菇原种、栽培种培养基常用的有麦粒培养基、腐熟粪草培养基和腐熟棉籽壳培养基。其中麦粒培养基最为常用，在麦粒培养基上菌丝生长速度快，菌丝生长旺盛，接种后具有生长点多、发菌快等特点。特别是麦粒易滚动，又易分散，“四面开花”形成生物种群的优势，有利于提高产量。下面介绍麦粒菌种的生产工艺和具体方法。生产工艺：选麦→洗麦→浸泡→沥干→水煮→加入辅料拌匀→装瓶→灭菌→冷却→接种→培养→检查→成品。

1. 原种、栽培种培养基常用配方

配方：麦粒100kg，腐熟干牛粪粉15kg，石膏2kg，含水量55%，适量石灰（约0.5kg）。调节pH值至7.5～8.0。

2. 原种、栽培种具体生产方法

（1）称量　首先根据配方准确称量麦粒、腐熟干牛粪粉及石膏、石灰。一般可用750ml菌种瓶，每瓶用小麦（干）0.20kg（若用聚乙烯袋每袋用干小麦0.3kg），其他根据配方计算牛粪及石膏粉的量，结合灭菌锅的容量，计算后称量。

（2）牛粪预处理　牛粪破碎后过筛，按1∶1.3加水拌匀，堆积发酵15～20天，牛粪粉变为褐色，具有正常发酵草料的清香气味，晒干，过筛备用（图1-54、图1-55）。

（3）选麦、洗麦、泡麦　小麦的品种要单一，因为品种不同，麦粒表层软硬不一，水煮时成熟度不一，不好掌握水煮时间。选择干净、无霉变、无虫蛀（虫蛀后的麦粒有孔洞，淀粉易流出）、未发芽、籽粒饱满的优质小麦。选好后用清水将小麦冲洗2～3遍，除去灰尘、麦糠等杂物。

在制种的前一天下午，用pH值10的石灰水（约1%石灰）浸泡小麦，夏天一般浸泡10～12h，春秋季气温低时浸泡15～20h。当年的麦粒可缩短浸泡时间，夏天制作时，浸泡麦粒过夜应换石灰水。泡麦时水池要大些，防止池中麦堆发热温度过高，并在泡麦的过程中要搅动几次。浸泡后要求基本无白心，不发芽（图1-56～图1-58）。

（4）煮麦、晾晒

①煮麦。将小麦捞出后在煮麦锅内煮沸，水沸腾后再煮20～30min，当麦粒从米黄色转为浅褐色，达到“无白心，不开花”的标准后及时捞出，沥干多余水分。煮麦时加水不可偏少，加热时不停地用木制工具搅拌，使受热均匀，防止胀裂。麦粒成熟度是麦粒菌种制作成败的关键。

②晾晒。将麦粒捞出，滤去多余的水分后，最好散铺在可滤水的器具内（如筛子），略晾晒，以表面不见水膜为度。如无过滤器具，也可迅速将小麦倒在事先消毒干净的水泥地面，厚3～5cm，晾去表面水分。待麦粒底层不积水，麦粒表面不沾水时，收成一堆（图1-59～图1-62）。

（5）拌麦　拌麦时将煮好的麦粒边加入腐熟干牛粪粉、石膏，边喷石灰水调节含水量和酸碱度，使含水量为55%，pH值为7.5～8.0，高温时可喷0.1%克霉灵（美帕曲星）预防杂菌（图1-63～图1-66）。　

（6）装瓶、装袋

①装瓶。通常选用容量750ml、瓶口内径3cm、耐126℃高温的无色或近无色的瓶子，装量为瓶高的3/4，每瓶填干麦粒

0.20kg。装料时用大嘴短径漏斗套住菌种瓶瓶口的内径，将上述麦粒边倒入漏斗套内边振动。装好料的瓶用清水洗净瓶口内、外壁上培养料，并将瓶口内、外壁擦干净，塞入棉塞，依次加塑料膜、报纸，并用皮套扎好（图1-67～图1-72）。

②装袋。通常选择规格为15cm×28cm×0.004cm的耐126℃高温的聚丙烯塑料袋。每袋装配制好的料300g，套上双套环或塞上棉塞（图1-73、图1-74）。

用棉塞封口，见图1-75～图1-78。

用双套环封口，见图1-79、图1-80。

（7）灭菌、冷却　灭菌室、冷却室要求做水磨石或油漆地面，四周墙壁和天花板油漆防潮，安装空气过滤装置。冷却室配备除湿和强制冷却设备，采用拉门结构，减少开关式门窗启动过程中的空气流通。灭菌锅最好是双门的，一门与有菌区（培养基制作室）相通，另一门与无菌区（冷却室）相通，双门不能同时开放。冷却室、接种室的大气压为正值，大约高出室外2.94×10⁴Pa，其中接种室气压要大于冷却室，冷却室大于缓冲室和培养室（图1-81、图1-82）。

麦粒培养基营养十分丰富，容易污染杂菌，一般采用高压灭菌方式，0.15MPa保持2h。在灭菌时要注意排尽锅内的冷空气，否则易造成假压，灭菌不彻底。消毒完毕后，不可人工排气降压，否则会使瓶或大袋大量破裂。应关闭热源后自然降压，当压力降到零后再排气，先慢排，后快排，最后排干净时再开盖。压力下降至零后，取出菌种瓶（袋）移入清洁和除尘处理后的冷却室，冷却到适宜温度。

灭菌后应进行“回接”实验，随机抽取5%（原种）、1%（栽培种）灭菌后菌种瓶（袋）作为样品，每批抽样数量不得少于10瓶（袋），超过100瓶（袋）的，可进行两级抽样，挑取其中的基质颗粒经过无菌操作接种于PDA培养基中，于28℃恒温培养2天，经检查无微生物长出的为灭菌合格。

（8）接种

①原种的接种（接种箱接种）。将冷却后的培养基装入接种箱，同时放入母种和接种工具，用甲醛和高锰酸钾混合熏蒸30min。也可用气雾消毒剂二氯异氰尿酸钠（4g/m²）熏蒸。

接种前双手经75%的酒精表面消毒后伸入接种箱，点燃酒精灯，对接种工具进行灼烧灭菌。然后将菌种瓶放到酒精灯一侧，松动棉塞。左手拿一支母种，右手拿接种钩（铲），右手小指和无名指夹住试管的棉塞并拔出，用接种钩挑取1.2～1.5cm²的母种块，再用小指和掌根取下瓶口的棉塞，迅速转移到原种培养基的表面中央，一般菌丝面向上，重新盖上试管和原种瓶的棉塞。重复以上操作，一般每支母种接5瓶原种（图1-83～图1-86）。

②栽培种的接种（接种室接种）。培养基灭菌结束后，一般应待其温度自然降至28℃以下或常温时，再移入接种箱或接种室内进行常规接种。接种过程与原种接种相似，只不过原种生产是将母种接入原种培养基，而栽培种生产是将原种接种到栽培种培养基。由于栽培种生产量大，所以可以在接种室内进行接种。

先将原种外壁和接种工具用75%酒精擦拭消毒，原种瓶（袋）口在酒精灯火焰上（旁）烧灼杀菌。接种时，拔去原种上的棉塞，用消毒冷却的接种铲将原种表面老化的菌种去掉，再换一个消毒冷却的接种铲将原种上层的1/3划散，然后取下栽培种培养基上的棉塞，套上一个大小适宜的消毒漏斗，将少量原种倒入栽培种培养基中，使原种均匀分布于培养基表面，用棉塞塞住瓶（袋）口。反复进行以上操作，当已划散的菌种用完后，再划下面1/3的菌种，接完后再划底层1/3菌种进行接种。一般每瓶原种接种栽培种30瓶。接种全部完成后移到培养室的培养架上，注明品种名称、接种日期、接种人姓名等，按菌种生产条件进行培养（图1-87～图1-92）。

（9）发菌　培养室应调温至23～25℃，尽量不超过28℃，空气相对湿度低于65%。培养室应避光、适量通风。培养阶段尽量采用空调设备降温，同时菌种间要有一定空隙，以防止菌种培养时产生的温度过高，影响菌丝的活力。一直在高温条件下培养的菌种，播种后不易吃料，发菌慢，产量会下降，务必慎之又慎。培养期间尽量减少人员出入，要做好病虫害的检查工作，对发生的各种污染，应严格剔除并移出培养室，分类处理。麦粒基质原种35～40天长满，栽培种30～40天长满，菌种种须在发满菌后再继续维持5～7天，此时是最佳菌龄（图1-93、图1-94）。

（10）菌种的检查　菌种培养期间，要经常检查。一般而言，接种3～5天进行第1次检查，在菌丝长满表层之前进行第2次检查，当菌丝长至瓶（袋）的1/3～1/2处进行第3次检查，当多数菌种长满时进行第4次检查。检查包括以下内容。

①萌发是否正常的检查。在进行第1次检查时，发现萌发缓慢或萌生出的菌丝细弱者要挑出。检查时要轻拿轻放，切忌大手大脚，随意取放，特别是检查袋时，不要用手提袋的颈圈部分，防止漏气感染杂菌。

②有无污染的检查。在菌丝长满培养料表面之前的2次检查中，都要仔细观察其是否污染，发现污染及时捡出。如果检查不及时，有些污染杂菌菌落可以被食用菌菌丝遮盖，到后来菌种长好时，肉眼不易鉴别，造成以后栽培种的大量污染。对污染的栽培种，切忌在培养室内开盖，以防杂菌孢子扩散。有链孢霉菌污染的，应用方便袋从上往下套住菌瓶，慢慢移出。对绿霉菌污染，应远离培养室倒料，并予焚烧或深埋。对一般杂菌的污染，可喷施药物后将料倒出，晒干后再次利用（图1-95、图1-96，彩图）。

③活力和生长势的检查。这一检查包含在整个培养期间的各次试验中。可观察的现象有菌丝的粗细、浓度、洁白度、整齐度以及生长是否有力。瓶内菌丝生长不健壮或有“退菌”现象，有杂菌和螨类滋生，有漂白粉或腥臭味等，均为不合格菌种。若菌种瓶内上部菌丝收缩变干，下部菌丝生长尚好，为培养基过干，培养温度过高；如果生长不均匀，表明麦粒浸泡和预煮时间不够；若生长中菌丝渐变黄，表明培养温度过高；若菌种瓶内上方出现很厚的菌被，是生产性能差或生理性状老化的菌种，不宜使用。合格菌丝应浓白、整齐、粗壮、上下均匀一致、有菇香味（图1-97、图1-98，彩图）。

（11）原种或栽培种保藏　原种或栽培种已成熟，一时间又用不完，可先将菌种放置于干燥、阴凉、避光且干净的房间内，瓶（袋）与瓶（袋）之间应拉开一定距离，注意温度、湿度的变化，常通风换气。有条件的可放到空调间内，温度调到4～5℃，空气相对湿度40%～50%，以防菌丝退化。储藏时要注意环境温度不能太高，以防菌种老化（图1-99、图1-100）。

（12）对购买原种、栽培种的挑选和鉴别

①问菌龄，问培养料。购买菌种时，先要问菌龄，菌龄直接影响以后的生产。另外要问培养料，不同的培养料菌种长势不完全相同，如麦粒种比粪草种菌丝要浓密洁白，加麦麸和豆粉的种比不加的要长势壮。不要因培养基营养的贫富而影响对菌种质量的判断，要根据培养料的不同而判断菌种。

②外观观察。菌丝是否健壮丰满，是否均匀、整齐，色泽是否纯正且上下一致。如果外相菌丝干瘪，可能是品种不好，或者菌龄过长。若菌体干缩，则表明菌龄过长，菌种老化。若菌丝散乱，则是不良的兆头。菌丝是否健壮有力而浓密，如果平淡无力，可能是品种退化，或培养条件不适，菌种活力差，不宜使用。色泽不纯正，有杂色则不可用。

③取出检查。取一有代表性的菌种，开盖挖出，一闻气味是否有浓郁的菇香味，二看菌丝是否连接紧密。如果菇味清淡或菌丝连接不紧（挖取时手感松散，不费劲地就可将菌种挖出），均不是优良菌种。

④无老化，无污染。老化菌种则出现老皮、色黄、大量的黄水、菌体干缩。污染的菌种，能从其表面看到污染菌的菌落，即使是这些菌落已经被食用菌遮盖，如果仔细观察，也能看到其踪迹。

3. 注意事项

①麦粒菌种生产主要环节是煮麦粒环节，一定要注意煮的程度，达到“无白心，不开花”的标准。因为麦粒开花后，黏度大，灭菌不容易彻底，而且接种后容易感染杂菌。

②工作人员必须经过严格的无菌训练，进入无菌区前需淋浴更衣。运输工具必须经灭菌或消毒后，方可进入无菌区使用，其他工具也一样。原料仓库要远离培养室，特别是粮食类原料是许多杂菌的主要菌源。栽培场地与制种场应当分开，否则杂菌容易进入制种场。培养基制作室和其他仓库实验室为有菌区，冷却室、接种室和培养室为无菌区，其中无菌区要求空气净化程度达到100级（按国家标准，凡是达到≥0.5μm的尘埃的量，≤3.5粒/L，即洁净度达到100级，表示环境中无菌）。

③培养麦粒菌种时，当菌种已经吃料封面后，为了加快菌种生长速度，可以采取摇瓶的方法，使菌种和麦粒充分混合，加快菌种生长速度。近年来，用塑料袋培养麦粒菌种因不用清洗、装料省工、运输方便而发展很快，但生产时特别要注意控制染菌率，一定要使用质量好的双套环，防止漏气，也可以加棉塞，确保不因漏气感染杂菌。

④双孢菇的液体菌种是发展的方向，特别是麦粒具有滚动性，液体菌种具有流动性，液体菌种的使用将提高菌种生产质量。在液体菌种的生产过程中，由于生产周期长，在液体菌种的生产过程中，笔者建议将双孢菇活化菌种直接接入摇瓶中，由于菌种基数大，分散度高，形成菌球的速度快，数量多而且均匀，在发酵罐生产中适度加大接种量有助于提高液体菌种质量和缩短发酵周期（图1-101、图1-102，彩图）。

⑤在生产中最大问题是菌种容器的透气问题，今后应加大透气性好菌种瓶和透气性好菌袋的使用，生产出质量更高的双孢菇菌种。

透气性好的菌种瓶一般为容量750ml，瓶口内径4cm，透明或近透明的耐126℃高温的聚丙烯塑料瓶（图1-103～图1-108）。

透气性好菌袋一般使用耐高温的具孔径0.2～0.5μm无菌透气膜的聚丙烯塑料袋，长、宽、厚一般为35cm×18cm×50μm，无菌透气膜1个，大小为5.5cm×5.5cm（图1-109、图1-110）。