第三节 灭菌与无菌技术

灭菌系指采用适当的物理或化学方法杀灭或除去物体上或物品中活的微生物（包括繁殖体和芽孢）的过程。微生物包括细菌、真菌、病毒等，微生物的种类不同，灭菌方法不同，灭菌效果也不同。细菌的芽孢具有较强的抗热能力，因此灭菌效果常以杀灭芽孢为标准。灭菌是药剂制备中一项重要的操作，对于注射剂、眼用制剂及应用于创面的制剂等无菌制剂是不可缺少的环节。药剂学中采用的灭菌措施必须达到既要除去或杀灭微生物，又要保证药物的稳定性、治疗作用及安全性的基本要求；其与微生物学的灭菌不尽相同。因此，选择灭菌方法必须把灭菌效果与药物性质结合起来一并考虑。药剂学中灭菌法可分为三大类：即物理灭菌法、化学灭菌法与无菌操作法。

一、药物制剂的卫生标准

为了确保药品安全有效，《中国药典》2010版一部附录XIII-C和二部Ⅻ-J微生物限度检查法项下对各类药物制剂的微生物限度有明确的规定。

（一）致病菌

口服药品每克或每毫升不得检出大肠杆菌，含动物药及脏器的药品同时不得检出沙门菌；外用药品每克或每毫升不得检出绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌；阴道、创伤、溃疡用制剂不得检出破伤风杆菌。

药物制剂检出大肠杆菌或其他致病菌时，均按一次检出结果为准，不再另行抽样复检，该产品则以不合格处理。

（二）活螨

螨的存在不仅可蛀蚀药品，使其变质失效，也可直接危害人体健康或传播疾病。因此，用于口服、创伤、黏膜和腔道的药品，不得检出活螨。

（三）细菌和霉菌

根据药物制剂实际工艺处理的情况，不同的剂型和给药方式有不同的细菌数和霉菌数的限度标准与要求。

1．口服给药制剂

（1）化学药物制剂或不含中药原粉的中药制剂 ①细菌数：每1g不得过1000个；每1mL不得过100个。②霉菌和酵母菌数：每1g或1mL不得过100个。③大肠埃希菌：每1g或1mL不得检出。

（2）含有中药原粉的中药制剂（如丸剂、全粉片、半浸膏片等） ①细菌数：每1g不得过10000个（丸剂每1g不得过30000个）；每lmL不得过500。②霉菌和酵母菌数：每1g或1mL不得过100个。③大肠菌群：每1g应小于100个；每1mL应小于10个。

（3）中药制剂中含有豆豉、神曲等发酵成分的制剂 ①细菌数：每1g不得过100000个；每1mL不得过1000个。②霉菌和酵母菌数：每1g不得过500个；每1mL不得过100个。③大肠埃希菌：每1g或1mL不得检出。④大肠菌群：每1g应小于100个；每1mL应小于10个。

2．局部给药制剂

（1）用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂 应符合无菌检查法无菌的规定。

（2）中药制剂中用于表皮或黏膜不完整的含中药原粉的局部给药制剂 ①细菌数：每1g，或10cm2 不得过1000个；每1mL不得过100个。②霉菌和酵母菌数：每1g、lmL或10cm2 不得过100个。③金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌：每1g、1mL或10cm2 不得检出。

（3）中药制剂中用于表皮或黏膜完整的含中药原粉的局部给药制剂 ①细菌数：每1g或10cm2 不得过10000个；每1mL不得过100个。②霉菌和酵母菌数：每1g、1mL或10cm2不得过100个。③金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌：每1g、1mL或10cm2 不得检出。

（4）耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂 ①细菌数：每1g、1mL或10cm2不得过100个。②霉菌和酵母菌数：每1g、1mL或10cm2不得过10个。③金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌：每lg、1mL或10cm2不得检出。④大肠埃希菌：鼻及呼吸道给药的制剂，每1g、1mL或10cm2不得检出。

（5）阴道、尿道给药制剂 ①细菌数：每1g或1mL不得过100个。②霉菌和酵母菌数：每1g或1mL应小于10个。③金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌：每1g或1mL不得检出。

（6）直肠给药制剂 ①细菌数：每1g不得过1000个；每1mL不得过100个。②霉菌和酵母菌数：每1g或1mL不得过100个。③金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌：每1g或1mL不得检出。

（7）其他局部给药制剂 ①细菌数：每1g、1mL或10cm2 不得过100个。②霉菌和酵母菌数：每1g、1mL或10cm2 不得过100个。③金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌：每1g、1mL或10cm2 不得检出。

（8）眼部给药制剂 ①细菌数：每1g或1mL不得过10个。②霉菌和酵母菌数：每1g或1mL不得检出。③金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌：每1g或1mL不得检出。

（9）注射剂 应无菌，照《中国药典》2010版附录Ⅻ-H无菌检査法检查，应符合规定。

3．含动物组织（包括提取物）及动物类原药材粉（蜂王浆、动物角、阿胶除外）的口服给药制剂 每10g或10mL不得检出沙门菌。

4．有兼用途径的制剂 应符合各给药途径的标准。

5．原料及辅料 参照相应制剂的微生物限度标准执行。

任何药品出现外观发霉、生虫或生活螨的现象，均应作不合格处理；液体制剂的瓶盖周围如出现发霉或有活螨，也作不合格处理。上述不合格的药品无需再抽样复检。

二、物理灭菌法

利用蛋白质与核酸具有遇热、射线不稳定的特性，采用加热、射线和过滤方法，杀灭或除去微生物的技术称为物理灭菌法，亦称物理灭菌技术。灭菌是制剂制备中的重要操作，对注射剂、眼用制剂等无菌制剂尤为重要。物理灭菌法分为干热灭菌法、湿热灭菌法、射线灭菌法、过滤灭菌法等。

（一）干热灭菌法

干热灭菌法系指在干燥环境中进行灭菌的技术，其中包括火焰灭菌法和干热空气灭菌法。

1．火焰灭菌法 系指用火焰直接灼烧灭菌的方法。该法灭菌迅速、可靠、简便，适用于耐火焰材质（如金属、玻璃及瓷器等）的物品与用具的灭菌，不适合药品的灭菌。

2．干热空气灭菌法 系指用高温干热空气灭菌的方法。该法适用于耐高温的玻璃和金属制品以及不允许湿气穿透的油脂类（如油性软膏基质、注射用油等）和耐高温的粉末化学药品的灭菌，不适于橡胶、塑料及大部分药品的灭菌。

在干燥状态下，由于热穿透力较差，微生物的耐热性较强，必须长时间受高热作用才能达到灭菌的目的。因此，干热空气灭菌法采用的温度一般比湿热灭菌法高。为了确保灭菌效果，一般规定为：135～145℃灭菌3～5h;160～170℃灭菌2～4h;180～200℃灭菌0.5～1h。

（二）湿热灭菌法

湿热灭菌法系指用饱和蒸气、沸水或流通蒸气进行灭菌的方法。由于蒸气潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，因此该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中最常用的方法。湿热灭菌法可分类为：热压灭菌法、流通蒸气灭菌法、煮沸灭菌法和低温间歇灭菌法。

1．热压灭菌法 系指用高压饱和水蒸气加热杀灭微生物的方法。该法具有很强的灭菌效果，灭菌可靠，能杀灭所有细菌繁殖体和芽孢，适用于耐高温和耐高压蒸气的所有药物制剂、玻璃容器、金属容器、瓷器、橡胶塞、滤膜过滤器等。

在一般情况下，热压灭菌法所需的温度（蒸气表压）与时间的关系为：115℃（67kPa）、30min;121℃（97kPa）、20min;126℃（139kPa）、15min。在特殊情况下，可通过实验确认合适的灭菌温度和时间。

影响热压灭菌的主要因素有：①微生物的种类与数量：微生物的种类不同，耐热、耐压性能存在很大差异，不同发育阶段对热、压的抵抗力不同，其耐热、耐压的次序为芽孢＞繁殖体＞衰老体。微生物数量愈少，所需灭菌时间愈短。②蒸气性质：蒸气有饱和蒸气、湿饱和蒸气和过热蒸气。饱和蒸气热含量较高，热穿透力较强，灭菌效率高；湿饱和蒸气因含有水分，热含量较低，热穿透力较差，灭菌效率较低；过热蒸气温度高于饱和蒸气，但穿透力差，灭菌效率低，且易引起药品的不稳定性。因此，热压灭菌应采用饱和蒸气。③药品性质和灭菌时间：一般而言，灭菌温度愈高，灭菌时间愈长，药品被破坏的可能性愈大。因此，在设计灭菌温度和灭菌时间时必须考虑药品的稳定性，即在达到有效灭菌的前提下，尽可能降低灭菌温度和缩短灭菌时间。④其他方面：介质pH对微生物的生长和活力具有较大影响。一般情况下，在中性环境微生物的耐热性最强，碱性环境次之，酸性环境则不利于微生物的生长和发育。介质中的营养成分愈丰富（如含糖类、蛋白质等），微生物的抗热性愈强，应适当提高灭菌温度或延长灭菌时间。

热压灭菌常用的设备为卧式热压灭菌柜，如图3-6所示。

卧式热压灭菌柜是一种常用的大型灭菌设备，该设备全部采用合金制成，具有耐高压性能，带有夹套的灭菌柜内备有带轨道的格车。压力表和温度表置于灭菌柜顶部，两压力表分别指示夹套内和柜内蒸气压力，两表中间为温度表。灭菌柜顶部安有排气阀，以便开始通入加热蒸气时排尽不凝性气体。

灭菌操作：先开夹套中蒸气加热10min，当夹套压力上升至所需压力时，将待灭菌物品置于金属编制篮中，排列于格车架上，推入柜室，关闭柜门，并将门闸旋紧。待夹套加热完成后，将加热蒸气通入柜内，当温度上升至规定温度（如12l℃）时，计时（此时即为灭菌开始时间），柜内压力表应固定在规定压力（如97kPa左右）。灭菌完成后，先关闭蒸气阀，排气至压力表降至“0”点，开启柜门，灭菌物品冷却后取出。

为保证灭菌效率，使用热压灭菌柜时应注意：①必须使用饱和蒸气。②必须排尽灭菌柜内空气：若有空气存在，压力表的指示压力并非纯蒸气压，而是蒸气和空气的总压，灭菌温度难以达到规定值。因此，在灭菌柜上往往附有真空装置，以便在通入蒸气前将柜内空气尽可能抽尽。③灭菌时间应以全部药液温度达到所要求的温度时开始计时：由于灭菌柜的表头温度是指灭菌柜内温度，而非灭菌物内部温度，最好设计直接测定被灭菌物内温度的装置或使用温度指示剂。④灭菌完毕后必须先停止加热，逐渐减压至压力表指针为“0”后，放出柜内蒸气，使柜内压力与大气压相等，稍稍打开灭菌柜，10～1 5min后全部打开，以免柜内外压力差和温度差太大，造成被灭菌物冲出或玻璃瓶炸裂而伤害操作人员，确保安全生产。

2．流通蒸气灭菌法 系指在常压下，采用100℃流通蒸气加热杀灭微生物的方法。灭菌时间通常为30～60min。该法适用于消毒及不耐高热制剂的灭菌。但不能保证杀灭所有的芽孢，不是可靠的灭菌法。

3．煮沸灭菌法 系指将待灭菌物置沸水中加热灭菌的方法。煮沸时间通常为30～60min。该法灭菌效果较差，常用于注射器、注射针等器皿的消毒。必要时可加入适量的抑菌剂，如三氯叔丁醇、甲酚、氯甲酚等，以提高灭菌效果。

4．低温间歇灭菌法 系指将待灭菌物置60～80℃的水或流通蒸气中加热60min，杀灭微生物繁殖体后，在室温条件下放置24h，让待灭菌物中的芽孢发育成繁殖体，再加热灭菌、放置，反复多次，直至杀灭所有芽孢。该法适合于不耐高温、热敏感物料和制剂的灭菌。其缺点是费时、工效低、灭菌效果差，加入适量抑菌剂可提高灭菌效率。

（三）过滤灭菌法

过滤灭菌法系指采用过滤法除去微生物的方法，该法属于机械除菌方法，该除菌装置称为除菌过滤器。该法适合于对热不稳定的药物溶液、气体、水等物品的灭菌。

灭菌用过滤器应有较高的过滤效率，能有效地除尽物料中的微生物，滤材与滤液中的成分不发生相互交换，滤器易清洗，操作方便等。为了有效地除尽微生物，滤器孔径必须小于芽孢体积（＞0.5μm）。常用的除菌过滤器有：0.22μm或0.3μm的微孔滤膜滤器和G6（号）垂熔玻璃滤器。过滤灭菌应在无菌条件下进行操作，为了保证产品的无菌，必须对过滤过程进行无菌检测。

（四）射线灭菌法

射线灭菌法系指采用辐射、微波和紫外线杀灭微生物和芽孢的方法。

1．辐射灭菌法 系指采用放射性同位素（60 Co和137Cs）放射的γ射线杀灭微生物和芽孢的方法，辐射灭菌剂量一般为2.5×104Gy（戈瑞）。本法适合于热敏物料和制剂的灭菌，常用于维生素、抗生素、激素、生物制品、中药材和中药制剂、医疗器械、药用包装材料及药用高分子材料等物质的灭菌。

2．微波灭菌法 采用微波（频率为300MHz～300kMHz）照射产生的热能杀灭微生物和芽孢的方法。该法适合液体和固体物料的灭菌，且对固体物料具有干燥作用。其特点是：微波能穿透到介质和物料的深部，可使介质和物料表里一致地加热；且具有低温、常压、高效、快速（一般为2～3min）、低能耗、无污染、易操作、易维护、产品保质期长（可延长1/3以上）等特点。

3．紫外线灭菌法 系指用紫外线（能量）照射杀灭微生物和芽孢的方法。用于紫外灭菌的波长一般为200～300nm，灭菌力最强的波长为254nm。该方法属于表面灭菌。

紫外线不仅能使核酸蛋白变性，而且能使空气中氧气产生微量臭氧，而达到共同杀菌作用。该法适合于照射物表面灭菌、无菌室空气及蒸馏水的灭菌；不适合于药液的灭菌及固体物料深部的灭菌。由于紫外线是以直线传播，可被不同的表面反射或吸收，穿透力微弱，普通玻璃即可吸收紫外线，因此装于容器中的药物不能用紫外线灭菌。紫外线对人体有害，照射过久易发生结膜炎、红斑及皮肤烧灼等伤害，故一般在操作前开启1～2h，操作时关闭；必须在操作过程中照射时，对操作者的皮肤和眼睛应采用适当的防护措施。

三、化学灭菌法

化学灭菌法系指用化学药品直接作用于微生物而将其杀灭的方法。对微生物具有触杀作用的化学药品称杀菌剂，可分为气体杀菌剂和液体杀菌剂。杀菌剂仅对微生物繁殖体有效，不能杀灭芽孢。化学灭菌的目的在于减少微生物的数目，以控制一定的无菌状态。化学杀菌剂的杀灭效果主要取决于微生物的种类与数量、物体表面光洁度或多孔性、以及杀菌剂的性质等。

（一）气体灭菌法

气体灭菌法系指采用气态杀菌剂（如环氧乙烷、甲醛、丙二醇、甘油和过氧乙酸蒸气等）进行灭菌的方法。该法特别适合环境消毒以及不耐加热灭菌的医用器具、设备和设施等的消毒，亦用于粉末注射剂，不适合对产品质量有损害的场合。同时应注意残留的杀菌剂和与药物可能发生的相互作用。

（二）药液灭菌法

药液灭菌法系指采用杀菌剂溶液进行灭菌的方法。该法常应用于其他灭菌法的辅助措施，适合于皮肤、无菌器具和设备的消毒。常用消毒液有：75%乙醇、1%聚维酮碘溶液、0.1%～0.2%苯扎溴铵（新洁尔灭）溶液、酚或煤酚皂溶液等。

四、无菌操作法

无菌操作法系指整个过程控制在无菌条件下进行的一种操作方法。该法适合一些不耐热药物的注射剂、眼用制剂、皮试液、海绵剂和创伤制剂的制备。按无菌操作法制备的产品，一般不再灭菌，但某些特殊（耐热）品种亦可进行再灭菌（如青霉素G等）。最终采用灭菌的产品，其生产过程一般采用避菌操作（尽量避免微生物污染），如大部分注射剂的制备等。

（一）无菌操作室的灭菌

无菌操作室的灭菌常采用紫外线、液体和气体灭菌法对无菌操作室环境进行灭菌。

1．紫外线灭菌 是无菌室灭菌的常规方法，该方法应用于间歇和连续操作过程中。一般在每天工作前开启紫外灯1h左右，操作间歇中亦应开启0.5～1h，必要时可在操作过程中开启（应注意操作人员眼、皮肤等的保护）。

2．液体灭菌 是无菌室较常用的辅助灭菌方法，主要采用3%苯酚溶液、2%煤酚皂溶液、0.2%苯扎溴铵或75%乙醇喷洒或擦拭，用于无菌室的空间、墙壁、地面、用具等方面的灭菌。

3．甲醛溶液加热熏蒸法 该方法的灭菌较彻底，是常用的方法之一。气体发生装置（图3-7）是采用蒸气加热夹层锅，使液态甲醛汽化成甲醛蒸气，经蒸气出口送入总进风道，由鼓风机吹入无菌室，连续3h后，关闭密熏12～24h，并应保持室内湿度＞60%，温度＞25℃，以免低温导致甲醛蒸气聚合而附着于冷表面，从而降低空气中甲醛浓度，影响灭菌效率。密熏完毕后，将25%的氨水经加热，按一定流量送入无菌室内，以清除甲醛蒸气，然后开启排风设备，并通入无菌空气直至室内排尽甲醛。

（二）无菌操作

无菌操作室、层流洁净工作台和无菌操作柜是无菌操作的主要场所，无菌操作所用的一切物品、器具及环境，均需按前述灭菌法灭菌，如安瓿应150～180℃、2～3h干热灭菌，橡皮塞应121℃、1h热压灭菌等。操作人员进入无菌操作室前应洗澡，并更换已灭菌的工作服和清洁的鞋子，不得外露头发和内衣，以免污染。

小量无菌制剂的制备，普遍采用层流洁净工作台（图3-8）进行无菌操作，该设备具有良好的无菌环境，使用方便，效果可靠。无菌操作柜目前常用于试制阶段。

五、灭菌参数及其影响因素

近年来对灭菌过程和无菌检查中存在的问题已引起人们的关注。在检品中存在微量的微生物时，往往难以用现行的无菌检验法检出。因此，有必要对灭菌方法的可靠性进行验证。F与F0值可作为验证灭菌可靠性的参数。

（一）D值与Z值

1．D值 研究表明，微生物受高温、辐射、化学药品等作用时就要被杀灭，其杀灭速度符合一级过程，即：

或

式中：N0——原有微生物数；

Nt——灭菌时间为t时残存的微生物数；

k——杀灭速度常数。

lgNt对t作图得一直线，斜率：，设斜率的负倒数为D值，即：

由式（3-5）可知，当时lgN0-lgNt=lg100-lg10=1, D=t，即D的物理意义为，在一定温度下杀灭微生物90%或残存率为10%时所需的灭菌时间（min）。

2．Z值 灭菌条件不同，其灭菌速率也不同。当温度升高时，速度常数k增大，因而D值（灭菌时间）随温度的升高而减少。在一定温度范围内（100～138℃）lgD与温度T之间呈直线关系。设：

故Z值为降低一个lgD值所需升高的温度数。即：灭菌时间减少到原来的1/10所需升高的温度。如Z=10℃，意思是：灭菌时间减少到原来灭菌时间的1/10，而灭菌效果不变所需升高的灭菌温度为10℃。式（3-5）可以改写为：

设Z=1 0℃, T1=110℃, T2=121℃，则D2=0.079D1。即110℃灭菌1min与121℃灭菌0.079min效果相当。

若Z=10℃，灭菌温度每增加一度，则D1=1.25 9D2，即温度每增加一度，其灭菌速率提高25.9%。

（二）F值与F0值

1．F值 F值为在一定灭菌温度（T）下给定的Z值所产生的灭菌效果与在参比温度（T0）下给定Z值所产生的灭菌效果相同时所相当的灭菌时间，以min为单位。F值常用于干热灭菌，其数学表达式如下：

式中：Δt——测量被灭菌物温度的时间间隔，一般为0.5～1min；

T——每个时间间隔Δt所测得被灭菌物的温度；

T0——参比温度。

2．F0值 F0值为一定灭菌温度（T）下，Z值为10℃时所产生的灭菌效果与121℃、Z值为10℃时所产生的灭菌效果相同时所相当的时间（min）。F0值目前仅限于热压灭菌。物理F0的数学表达式为：

根据式（3-9），在灭菌过程中，仅需记录被灭菌物的温度与时间，即可计算F0值。由于F0 值是将不同灭菌温度计算到相当于121℃热压灭菌时的灭菌效力，故F0 值可作为灭菌过程的比较参数，对灭菌过程的设计及验证灭菌效果极为有用。鉴于F0值体现了灭菌温度与时间对灭菌效果的统一，该数值更为精确、实用。

生物F0值的数学表达式为：

即生物F0值可看做D121℃与微生物数目的对数降低值的乘积。式中Nt为灭菌后预计达到的微生物残存数，即染菌度概率（probability of nonsterility），当Nt达到10-6时（原有菌数的百万分之一），可认为灭菌效果较可靠。因此，生物F0值可认为是以相当于121℃热压灭菌时，杀灭容器中全部微生物所需要的时间。

影响F0值的因素主要有：①灭菌产品溶液性质、充填量等；②容器大小、形状及热穿透性等；③容器在灭菌器内的数量及分布等，该项因素在生产过程中影响最大，故必须注意灭菌器内各层、四角、中间位置热分布是否均匀，并根据实际测定数据，进行合理排布。

测定F0值时应注意的问题：①选择灵敏度高，重现性好，使用精密度为0.1℃的热电偶，并对其进行校正；②灭菌时应将热电偶的探针置于被测样品的内部，经灭菌器通向灭菌柜外的温度记录仪（一般附有F0显示器）; ③对灭菌工艺和灭菌器进行验证，灭菌器内热分布应均匀，重现性好。

为了确保灭菌效果，应严格控制原辅料质量和环境条件，尽量减少微生物的污染，采取各种有效措施使每一容器的含菌数控制在一定水平以下（一般含菌数为10以下，即lgNt＜1）；计算、设置 F0值时，应适当考虑增加安全系数，一般增加理论值的50%，即规定 F0值为8min，实际操作应控制在12min。